NK-92細胞培養的注意事項

NK-92細胞特性

NK-92細胞生長特性為(wei) 懸浮生長，收到細胞後先觀察瓶身是否完整，無漏液現象，培養(yang) 基是否澄清透亮，在顯微鏡下觀察細胞；

用75%的酒精擦拭瓶身後將細胞培養(yang) 瓶先豎立靜置2~4個(ge) 小時，讓細胞沉降到底部；細胞靜置完後，將瓶中上麵部分培養(yang) 基小心吸出，留底部細胞和3ml左右培養(yang) 基在原瓶；

吸出的細胞培養(yang) 基離心收集細胞沉澱，離心轉速1000轉3分鍾，或根據您的離心機實際情況而定，NK-92細胞對離心敏感，轉速不宜過高；用2~3mlNK-92完培將得到的細胞沉澱重懸後，放回原瓶繼續培養(yang) 過夜，一個(ge) T25培養(yang) 體(ti) 積是5~6毫升；

NK-92細胞可按照200U/ml的濃度補加IL-2。

培養(yang) 瓶為(wei) 不透氣瓶蓋，一定要擰鬆到不掉的程度，使細胞充分透氣；培養(yang) 瓶橫放，瓶口擰鬆透氣，培養(yang) 過夜；

顯微鏡下觀察細胞，視細胞密度和培養(yang) 基消耗情況，進行傳(chuan) 代。不建議直接進行離心操作，因為(wei) 經過運輸顛簸和各種處理，細胞很可能達不到最佳狀態。盡量不要吹散細胞團，加完液輕晃培養(yang) 瓶即可。

細胞培養(yang) 注意事項

NK-92細胞為(wei) 懸浮生長，大部分細胞聚集成團，少數細胞分散，並且細胞間隙會(hui) 有較多的死細胞和細胞碎片，且培養(yang) 過程中經常能觀察黑色的顆粒和小黑點，這些黑點大概是細胞帶的，一般少量黑點不增殖不會(hui) 影響細胞的生長，若黑點繁殖生長則懷疑細胞汙染，會(hui) 影響細胞生長，甚至使細胞死亡。

NK-92細胞對IL-2敏感。培養(yang) 基中IL-2降解，將導致細胞狀態變差。IL-2長期保存溫度為(wei) -20℃，解凍後置於(yu) 4℃冰箱保存，4℃保存不應超過兩(liang) 周。配製好的新鮮培養(yang) 基要盡快用完，使用前預熱，使用完畢後放回4℃冰箱保存；

NK-92細胞對離心敏感。正常培養(yang) 時，換液周期為(wei) 2~3天，建議交替使用半量換液和離心換液法，即半量換液2~3次後，離心全量換液一次。盡量減少離心次數，細胞狀態不佳或細胞量少的時候，一般不建議離心。

細胞團塊是否需要吹散？

團塊需要吹散，但不用刻意吹散成單顆；

正常傳(chuan) 代或者離心換液後吹打，控製吹打次數以及力度，即使細胞都分散成單個(ge) ，也會(hui) 在1~2天內(nei) 聚集起來；細胞團太大時，需要分散；

細胞凍存的時候，細胞需要盡量分散，否則影響凍存效果。

換液方法
(1) 補液法：每2~3天補加適量（根據培養(yang) 容器和原來細胞懸液體(ti) 積來定，T25瓶一次補液1~2毫升即可）新鮮培養(yang) 基，同時補加200U/mlIL-2，補加2-3次之後，離心全部換液。

(2) 半換液法：以T25瓶子（瓶中裝有5ml培養(yang) 基）為(wei) 例，豎起瓶子靜置一段時間（豎瓶前輕拍培瓶，讓輕貼底部的細胞團浮起來），待細胞沉底（肉眼觀察細胞沉底情況），小心吸出2.5ml上清轉移到離心管，1000rpm 3~5min離心，離心後的細沉澱用2.5ml新鮮培養(yang) 重懸後放回原瓶繼續培養(yang) 。細胞生長時，聚集的細胞團會(hui) 逐漸增大，正常的細胞團在顯微鏡下呈現白色透亮狀。若細胞聚集太多，出現細胞團中部發暗時，可進行傳(chuan) 代。

傳(chuan) 代方法

將細胞團用移液器輕輕吹散（一般吹2-3次即可，吹打力度不可過大，否則會(hui) 出現大量死細胞和細胞碎片），均分到兩(liang) 個(ge) 瓶子裏，每瓶再補充等量培養(yang) 基。細胞對營養(yang) 要求很高，細胞量過多時會(hui) 影響細胞生長；細胞團塊過大時，需要稍微吹散，注意控製吹打次數，不需要全部吹散。

細胞凍存

推薦使用90%FBS+10%DMSO的凍存液配比，NK-92細胞可適量補加IL-2；盡量吹散細胞，注意控製吹打力度。

細胞複蘇

複蘇後，用6ml新鮮培養(yang) 基，重懸細胞；離心後去除上清用1~2mL培養(yang) 基重懸細胞，注意要少次輕柔吹打。
瓶子豎著放進培養(yang) 箱，以增加細胞局部密度，瓶蓋保持透氣；
細胞生長需要穩定的環境，可每天觀察1次，不要頻繁拿出培養(yang) 箱觀察